Close

Opracowanie czułej metody klasyfikacji analizowanych białek za pomocą markerów molekularnych KASP.

Metodyka opracowana w ramach realizacji Programu Wieloletniego MRiRW, zad. 2.1. za rok 2020

Sebastian Gasparis, Anna Nadolska-Orczyk, Zakład Genomiki Funkcjonalnej IHAR-PIB, Radzików, 05-870 Błonie

Identyfikację podjednostek białek gluteninowych pszenicy wykonuje się najczęściej metodą rozdziału elektroforetycznego SDS-PAGE. Poszczególne podjednostki rozróżniane są na podstawie wzoru prążków na żelu poliakrylamidowym. Jest to metoda czasochłonna i pracochłonna, i wymaga dojrzałego ziarna do izolacji białka. Ponadto, analiza ta jest obarczona dużym błędem, ponieważ wiele podjednostek gluteninowych daje podobny lub taki sam wzór prążków. Ze względu na wysoką specyficzność, technika KASP jest dokładniejsza od SDS-PAGE. Analizowanym materiałem jest DNA, które można pobrać na każdym etapie rozwoju rośliny. KASP jest metodą wysokoprzepustową, pozwalającą na analizę dużej ilości prób w krótkim czasie (kilka godzin vs kilka dni w metodzie SDS-PAGE).

Technika KASP (z ang. Competitive Allele Specific PCR) służy do wykrywania polimorfizmu pojedynczych nukleotydów (SNP) w sekwencji DNA i jest wykorzystywana głównie do identyfikacji wariantów alleli danego genu. Technika ta opiera się na reakcji PCR z użyciem starterów specyficznych dla danego allelu oraz sond molekularnych, komplementarnych z danym starterem, znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym. Poszczególne warianty alleli identyfikowane są na podstawie sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez sondę. Na rys. 1 przedstawiono wynik przykładowej reakcji PCR mającej na celu identyfikację alleli A i B w populacji różnych odmian pszenicy. Mieszanina reakcyjna PCR zawierała trzy rodzaje starterów: starter specyficzny dla sekwencji allelu A, starter specyficzny dla sekwencji allelu B oraz starter wspólny, specyficzny dla obu alleli. Ponadto, mieszanina reakcyjna PCR zawierała dwa rodzaje sond molekularnych, znakowanych barwnikami FAM i HEX. Sonda FAM była specyficzna dla allelu A, natomiast sonda HEX dla allelu B. W końcowym etapie reakcji amplifikacji następowała detekcja sygnału fluorescencyjnego z poszczególnych sond. Poziom fluorescencji FAM i HEX został znormalizowany wobec fluorescencji barwnika referencyjnego ROX. Następnie próby pogrupowano według poziomu fluorescencji FAM i przedstawiono na wykresie punktowym. Wysoki poziom fluorescencji FAM i niski poziom fluorescencji HEX oznacza, że dana odmiana posiadała allel A, ponieważ tylko jego sekwencja uległa amplifikacji. Próby oznaczone kolorem niebieskim są zatem homozygotami allelu A. Analogicznie, próby z wysoką fluorescencją HEX i niską fluorescencją FAM ( kolor czerwony) są homozygotami allelu B, natomiast próby z podobnym poziomem fluorescencji FAM i HEX (kolor zielony) to heterozygoty posiadające oba allele. Próba ślepa (kolor czarny) nie zawierała matrycy DNA, a sygnał fluorescencji pochodził jedynie z barwnika referencyjnego ROX.

 

Skip to content