Metody genetycznej identyfikacji zasobów genowych

W związku z postępującą degradacją środowiska naturalnego coraz więcej gatunków wymaga ochrony. Możemy wyróżnić dwie strategie ochrony:

1. a) In situ, polegającą na ochronie roślin w ich naturalnym środowisku. Metoda ta pozwala na kompleksową ochronę całych ekosystemów przez tworzenie obszarów chronionych, np. rezerwatów, co umożliwia zachowanie pierwotnej zmienności genetycznej gatunków w ich naturalnym środowisku.
2. b) Ex situ, opierająca się na ochronie roślin poza naturalnym stanowiskiem m.in. w bankach genów. Zadaniem banku genów jest przechowywanie zasobów genowych w możliwie niezmienionej postaci przy ograniczeniu wpływu czynników zewnętrznych. Dodatkowo banki genów oceniają, opisują zgromadzone materiały oraz udostępniają je hodowlom, instytucjom naukowym i innym zainteresowanym.

Rys. 1. Avena sativa zdeponowana w kolekcji Banku Genów IHAR-PIB.

Ze względu na dużą liczebność kolekcji zgromadzonych w bankach genów na całym świecie, jedno z największych wyzwań stanowi dokładna charakterystyka obiektów. Prace prowadzone w laboratoriach molekularnych obejmują identyfikację materiałów zgromadzonych w bankach, identyfikowanie i eliminowanie duplikatów, określanie genotypów oraz dokładną charakterystykę nowych obiektów. Analizy mają na celu wyodrębnienie cennych materiałów przechowywanych w bankach genów.

W ostatniej dekadzie rozpoczął się okres dynamicznej eksploracji genomów. Postęp technologii sekwencjonowania czyli techniki odczytywania kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA oraz projekty sekwencjonowania genomów roślinnych umożliwiają lepsze zrozumienie procesów rozwojowych, ewolucyjnych oraz dokładną charakterystykę badanych obiektów. Zapoczątkowanie sekwencjonowania drugiej generacji umożliwiło wysokoprzepustowe sekwencjonowanie milionów stosunkowo krótkich fragmentów genomu przy zachowaniu wysokiej wiarygodności odczytu. Koszty, wysoka przepustowość oraz czas przeprowadzania reakcji sekwencjonowania w przeliczeniu na jednostkę uzyskanej informacji są wielokrotnie niższe w porównaniu do starszych technik.

W Krajowym Centrum Roślinnych Zasobów Genowych identyfikację obiektów prowadzi się metodami tradycyjnymi na podstawie porównania cech fenotypowych (morfologia, wzrost, plonowanie, odporność na choroby), ale również z wykorzystaniem metod biologii molekularnej opartej na sekwencjonowaniu II generacji przy wykorzystaniu platformy Illumina MiSeq. W związku z dużymi rozmiarami genomów roślinnych, wykorzystuje się metody oparte o redukcję frakcji genomu. Sekwencjonowanie NGS (ang. Next Generation Sequencing) bibliotek o zredukowanej frakcji genomu (RRS ang. reduced representation sequencing) to efektywna technika identyfikacji nowych i dyskryminacji znanych polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. RRS jest uważana za prostą i mało czasochłonną metodę. Ilość danych generowanych w wyniku analiz RRS jest wystarczająca do szerokiego spektrum celów badawczych w zakresie genetyki roślin.

Rys. 2. Sekwenator II generacji Illumina MiSeq.

Pierwszym z etapów sekwencjonowania, jest odpowiednie przygotowanie próbek. Prawidłowe przygotowanie próbek umożliwia wydajną pracę urządzenia i otrzymanie wartościowych wyników. Etap przygotowania prób do sekwencjonowania składa się z przygotowywania bibliotek kwasów nukleinowych, a następnie ich powielania. W celu redukcji genomu, konstruujemy biblioteki metodą ddRADSeq (ang. double digest restriction-site associated DNA), wykorzystującą od 0,1 do 10% genomowego DNA. Redukcji dokonuje się poprzez trawienie DNA dwoma enzymami restrykcyjnymi.

Metoda ddRADSeq (rys. 3) umożliwia próbkowanie DNA poprzez trawienie DNA dwoma enzymami restrykcyjnymi. Aby zoptymalizować liczbę uzyskanych fragmentów DNA stosuje się dwa różne enzymy: często i rzadko tnące. W kolejnym etapie do lepkich końców (kilkunukleotydowe jednoniciowe odcinki DNA znajdujące się na końcu dwuniciowego DNA, mogą tworzyć wiązania z innymi lepkimi końcami DNA o sekwencji komplementarnej i w ten sposób łączyć dwie cząsteczki) wytworzonych w wyniku enzymatycznego trawienia przyłączane są adaptory (syntetycznych cząsteczek DNA o znanej sekwencji). Po zakończeniu konstrukcji bibliotek są one powielane w wyniku amplifikacji, a następnie sekwencjonowane. Uzyskane w wyniku sekwencjonowania surowe wyniki są następnie poddawane obróbce bioinformatycznej.

Rys. 3. Etapy konstrukcji bibliotek ddRADSeq.

Technologia ddRaDSeq pozwala na wytworzenie dużej liczby markerów i konstrukcję wysokiej jakości map genetycznych. Metoda generuje tysiące SNP’ów pozwalających na konstrukcję drzew filogenetycznych (rys. 4) oraz wykrywanie zmienności genetycznej populacji. Dodatkowo analizy pozwalają na identyfikację oraz charakterystykę obiektów zgromadzonych w bankach genów. Przedstawione na rysunku 4 wyniki pozwalają na stwierdzenie o stopniu podobieństwa genotypów (zespół genów danego osobnika warunkujących jego fenotyp) badanych prób oraz identyfikacji obiektów trudnych do rozpoznania poprzez ocenę fenotypową. Dodatkowo analizy pozwalają na wyznaczenie wśród prób duplikatów, co umożliwia przechowywanie unikatowych materiałów w banku genów.

Rys. 4. Wyniki uzyskane w toku sekwencjonowania NGS obiektów Avena zgromadzonych w Banku Genów (A- Heat map; B-Drzewo filogenetyczne).

__
mgr Marta Puchta
Krajowe Centrum Roślinnych Zasobów Genowych
Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin – PIB